光學(xué)顯微鏡的使用及示教片的觀(guān)察

        一、實(shí)驗目的 1、學(xué)習和掌握油杯的使用原理和方法。 2、復習普通臺式顯微鏡各部分的結構、功能和使用方法。 2、顯微鏡的基本結構和油鏡的工作原理?，F代普通光學(xué)顯微鏡采用目鏡和物鏡兩種透鏡系統進(jìn)行放大成像，因此常被稱(chēng)為復合顯微鏡。它們由兩部分組成：機械裝置和光學(xué)系統。在顯微鏡的光學(xué)系統中，物鏡的性能關(guān)鍵，它直接影響著(zhù)顯微鏡的分辨率。在普通光學(xué)顯微鏡常用的幾種物鏡中，油鏡的放大倍數，是微生物研究中最重要的。與其他物鏡相比，油鏡的使用比較特殊，需要在載玻片和鏡頭之間加一滴鏡頭油。這主要是以下兩個(gè)原因： 1. 增加照明油透鏡的亮度，放大倍數可以達到100 Χ，這么大的放大倍數的鏡頭焦距短，直徑小，但所需的光強是的。載有標本的載玻片發(fā)出的光，由于介質(zhì)密度不同（從載玻片進(jìn)入空氣，再進(jìn)入透鏡），部分光線(xiàn)會(huì )因折射或全反射而無(wú)法進(jìn)入透鏡，導致使用油鏡由于光線(xiàn)較少，物體的圖像不清晰。因此，為了不損失通過(guò)的光線(xiàn)，在使用油鏡時(shí)，必須在油鏡和玻璃（通常是雪松油，其折射率為指數為 n = 1.52）。 2、提高顯微鏡的分辨率 顯微鏡的分辨率或分辨力是指顯微鏡分辨兩點(diǎn)之間最小距離的能力。從物理角度來(lái)看，光學(xué)顯微鏡的分辨率受光干涉現象和所用物鏡性能的限制。分辨率D可以表示為：D=λ/2N.A，其中λ=光的波長(cháng)； NA=物鏡數值孔徑值。光學(xué)顯微鏡的光源不能超過(guò)可見(jiàn)光的波長(cháng)范圍（0.4-0.7μm），數值孔徑值取決于物鏡的透鏡角度和載玻片與透鏡之間介質(zhì)的折射率，可表示為： NA=n × 在sin α的公式中，α為光入射角的一半。這取決于物鏡的直徑和焦距。一般來(lái)說(shuō)，實(shí)際應用中只能達到120 O，n為介質(zhì)的折射率。由于雪松油的折射率 (1.52）高于空氣和水的折射率（分別為1.0和1.33），所以以雪松油為介質(zhì)的鏡片與玻璃之間的油鏡所能達到的數值孔徑值（NA一般為1.2-1.4）為更高 適用于低倍鏡和高倍鏡（NA低于1.0）等干式鏡片。如果以可見(jiàn)光的平均波長(cháng)0.55μm計算，數值孔徑通常在0.65左右的高倍透鏡只能分辨距離不小于0.4μm的物體，而油性透鏡的分辨率可以達到0.2μm左右.三、實(shí)驗設備 1、菌株：枯草芽孢桿菌染色玻片標本。青霉菌（Penicillium sp.）水封等（教師可根據具體情況選擇菌種）。 2、溶液或試劑：雪松油、乙醇：yi醚混合物 3、儀器或其他用具：顯微鏡、擦鏡紙等 4、操作步驟 1、觀(guān)察前的準備 （1）顯微鏡的放置：將顯微鏡放在平板實(shí)驗臺，鏡頭卡口距實(shí)驗臺邊緣約3-4cm。顯微鏡檢查時(shí)姿勢應正確。用一只手握住顯微鏡的臂，另一只手握住底座，以保持顯微鏡直立和穩定。不要用一只手搬運；無(wú)論您使用單目顯微鏡還是雙目顯微鏡，都應同時(shí)睜開(kāi)雙眼進(jìn)行觀(guān)察，以減少眼睛疲勞，同時(shí)也便于在繪圖或記錄時(shí)進(jìn)行觀(guān)察。 (2)光源調節：安裝在鏡架上的光源燈可以通過(guò)電壓調節，以獲得合適的照明亮度，當使用反射器收集自然光或光作為照明光源時(shí)，應根據光源的強度和物鏡的放大倍數采用凹面或凸面反射鏡并調整其角度，使視場(chǎng)內光線(xiàn)均勻，亮度適宜。 (3)根據用戶(hù)的個(gè)人情況調整雙目顯微鏡的目鏡。雙目顯微鏡的目鏡間距可以適當調節，左目鏡一般配有屈光度調節環(huán)，可以適應不同的眼距或視力。不同觀(guān)察者的差異。 (4)聚光器數值孔徑的調節：調節聚光器的光圈孔徑值，使其與物鏡的數值孔徑值一致或略低。有些顯微鏡的聚光鏡只標注了數值孔徑值，并沒(méi)有具體的孔徑刻度。使用本顯微鏡時(shí)，可以在樣品聚焦后取下目鏡，在從鏡筒觀(guān)察視野的同時(shí)放大光圈。調整光圈邊緣與物鏡黑圈相切或略小于其邊緣。.由于每個(gè)物鏡的數值孔徑不同，每次更換物鏡時(shí)都要進(jìn)行這種調整。聚光鏡的數值孔徑值確定后，如果需要改變光強，可以通過(guò)升降聚光鏡或改變光源的亮度來(lái)實(shí)現。原則上不應通過(guò)虹彩光圈進(jìn)行調整。當然，虹彩光圈的使用原理、聚光鏡的高度和照明光源的強度都不是固定的。只要能獲得良好的觀(guān)察效果，有時(shí)可以根據不同的具體情況靈活使用，不一定是固定的。 2、對于顯微觀(guān)察，在目鏡不變的情況下，不同倍率物鏡所能達到的分辨率和放大倍數是不同的。一般情況下，特別是初學(xué)者，在進(jìn)行顯微觀(guān)察時(shí)，應遵循從低倍到高倍再到油鏡的觀(guān)察程序，因為低倍物鏡的視場(chǎng)比較大，容易找到目標和確定檢查位置。 (1)低倍觀(guān)察金黃色葡萄球菌染色標本。將載玻片放在載物臺上，用樣品夾夾住，移動(dòng)推進(jìn)器，使觀(guān)察對象直接位于物鏡下方。降低 10X 物鏡使其靠近樣品。用粗調器慢慢抬起鏡筒，使標本初步聚焦在視野內，然后用微調器將圖像調得清晰。緩慢移動(dòng)載玻片通過(guò)載玻片夾推桿，仔細觀(guān)察標本的各個(gè)部位，找到合適的目標，仔細觀(guān)察并記錄觀(guān)察結果。任何時(shí)候用粗調器對圖像進(jìn)行調焦時(shí)，要養成從側面仔細調整靠近標本的物鏡*的習慣，然后用目鏡觀(guān)察，慢慢調整遠離標本的物鏡準直，以免暫時(shí)誤操作。損壞鏡頭和載玻片。 (2) 用高倍鏡觀(guān)察。在低倍鏡下找到合適的觀(guān)察目標并將其移至視野中心后，輕輕轉動(dòng)物鏡轉盤(pán)，將高倍鏡移至工作位置。適當調整聚光器孔徑和視野亮度后，微調微調器使物像清晰，用螺旋槳移動(dòng)試樣仔細觀(guān)察并記錄觀(guān)察結果。一般情況下，當物像已經(jīng)在物鏡中清晰聚焦后，物鏡轉至工作位置觀(guān)察時(shí)，物像基本保持在焦點(diǎn)上。這種現象稱(chēng)為物鏡共焦（parfocal）。利用這種共焦現象，可以保證在使用高倍率或高倍率短工作距離的油鏡時(shí)，僅用微調器就可以清晰聚焦物像，避免使用粗調器的可能.誤操作損壞鏡頭或載玻片。 (3)油鏡觀(guān)察高倍鏡或低倍鏡找到要觀(guān)察的樣品區域后，用粗調器將鏡筒抬高，然后將油鏡轉到工作位置。在待觀(guān)察的樣品區加一滴雪松油，從側面看，用粗調器小心地降低鏡筒，使油鏡浸入鏡油中，幾乎與鏡筒接觸。標本。將聚光鏡升至位置并打開(kāi)全孔徑。如果使用的冷凝器的數值孔徑超過(guò) 1.0，請在冷凝器和載玻片之間加入一滴雪松油，以確保其效率。調整照明，使視野的亮度合適。使用粗調器緩慢抬起鏡筒，直到視野中出現物體圖像，然后使用微調器使其清晰對焦。有時(shí)按上述操作找不到目標物體，可能是油鏡沒(méi)有降到位，或者油鏡升得太快，使眼睛無(wú)法捕捉到經(jīng)過(guò)物體的圖像。在這種情況下，您應該重新操作。此外，要特別注意不要在降低鏡頭時(shí)用力過(guò)大或在調整焦距時(shí)錯誤地將粗調器向相反方向轉動(dòng)而損壞鏡頭和載玻片。三、顯微鏡使用后的處理 (1) 抬起鏡筒，取下載玻片。 (2)用擦鏡紙擦去鏡頭上的擦鏡油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（雪松油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留的油，最后用干凈的鏡頭清潔紙 去除殘留的二甲苯。 (3)用鏡頭清潔紙清潔其他物鏡和目鏡；用絲布清潔顯微鏡的金屬部分。 (4)還原各部分，反射鏡垂直于鏡座，將物鏡轉成“八"字形，然后向下旋轉。同時(shí)，降低聚光鏡以避免物鏡和聚光鏡碰撞的風(fēng)險。五、實(shí)驗報告 1、畫(huà)出你在低倍、高倍和油鏡下觀(guān)察到的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌和青霉菌的形態(tài)，包括三種情況下的視野品種。還要注明物鏡放大倍數和總放大倍數。六、問(wèn)題 1、用油鏡觀(guān)察時(shí)應注意哪些問(wèn)題？載玻片和鏡片之間加什么油？它扮演什么角色？ 2、測試單比較了低倍鏡、高倍鏡和油鏡的區別。為什么在使用高倍鏡和油鏡時(shí)要特別注意避免粗調器誤操作？ 3、物鏡的共焦現象是什么？它在顯微觀(guān)察中有什么意義？ 4、影響顯微鏡分辨率的因素有哪些？ 5.根據你的實(shí)驗經(jīng)驗，談?wù)勅绾胃鶕^(guān)察微生物的大小選擇不同的物鏡進(jìn)行有效觀(guān)察。